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RIP技術(RNA結合蛋白免疫沉澱)-上海一色桃子在线视频生物科技有限公司


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      RIP技術(RNA結合蛋白免疫沉澱)

      型    號:
      更新時間: 2017-08-03

      RIP技術(RNA結合蛋白免疫沉澱)
      RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉澱),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。分析與目的蛋白結合的RNA.運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,然後經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA進行分析

      產品介紹:

       

      RIP技術(RNA結合蛋白免疫沉澱)

      RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉澱)是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。分析與目的蛋白結合的RNA.運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,然後經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA進行分析;即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白,防止非特異性的RNA的結合,免疫沉澱把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來,結合的RNA序列可通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或 高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉錄後調控網絡動態過程的有力工具,能幫助一色桃子在线视频發現miRNA的調節靶點。

       

      RIP實驗流程
      (一). 細胞裂解液獲取
      A. 單層細胞或者貼壁細胞處理
      1. 冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
      2. 加入冷PBS後用細胞刮將細胞刮下來,收集至enpendoff管
      3. 1500rpm,4離心5min,棄上清,收集細胞
      4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻後於冰上靜置5min
      5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存於-80
      B. 懸浮細胞處理:先收集細胞再計數,然後清洗裂解
      C. 組織樣品處理
      1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
      2. 加入冷PBS後,用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個細胞,計數
      3. 1500rpm,4離心5min,棄上清,收集細胞
      4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻後置於冰上靜置5min
      5. 每管分裝200ul細胞裂解液,貯存於-80
      (二). 磁珠的準備
      A. 實驗前準備
      1、enpendoff管
      2、磁力架
      3、冰盒, RIP Wash Buffer置於冰上
      4、抗體,置於冰上
      5、渦旋震蕩器
      6、槍、槍頭放於超淨台照射30min,槍噴DEPC水
      B. 磁珠準備過程
      1. 重懸磁珠
      2. 標記實驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽性對照
      3. 吸取50ul 重懸後的磁珠懸液於每個enpendoff管
      4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩
      5.將enpendoff管置於磁力架上,並左右轉動15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重複一次
      6.用100ul的RIP Wash Buffer重懸磁珠,加入約5ug相應抗體於每個樣品中
      7. 室溫孵育30min
      8. 將enpendoff管置於磁力架上,棄上清
      9. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩後棄上清,重複一次
      10. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩後置於冰上
      (三). RNA結合蛋白免疫沉澱
      A. 準備工作
      1、冰盒
      2、360°旋轉儀
      3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置於冰上
      B. RNA結合蛋白免疫沉澱實驗過程
      1.準備RIP Immunoprecipitation Buffer
      2.將前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
      3. 迅速解凍*步製備的細胞裂解液,14,000rpm,4離心10min。吸取100ul上清液於上一步的磁珠-抗體複合物中,使得總體積為1ml
      4. 4孵育3h至過夜
      5. 短暫離心,將enpendoff管放在磁力架上,棄上清
      6. 加入500ul RIP Wash Buffer,渦旋震蕩後將enpendoff管放在磁力架上,棄上清,重複清洗6次
      (四). RNA純化
      A. 實驗前準備
      1.槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min,噴DEPC水以除RNA酶
      2. Salt Solution、Salt Solution、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置於冰上
      3.RNase-free的乙醇、(lv)仿、異戊醇
      4.DEPC水置於冰上
      5. 離心機預冷
      6. 冰盒
      B. RNA純化過程
      1.準備Proteinase K Buffer。每個樣品需150ul
      2.用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體複合物
      3. 55孵育30min
      4. 孵育完之後,將enpendoff管置於磁力架上,將上清液吸入一新的enpendoff管中
      5. 於每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
      6. 於每管加入400ul苯酚:lv仿:異戊醇,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
      7. 小心的吸取350ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
      8. 於每管加入400ullv仿,渦旋震蕩15s,室溫下14,000rpm離心10min
      9. 小心的吸取300ul上層水相,吸入另一新的enpendoff管
      10. 每管加入50ul Salt Solution,15ul Salt Solution,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 無水乙醇(無RNase),混合,-80保持1h至過夜
      11. 14,000rpm,4離心30min,小心去上清
      12. 用80%乙醇衝洗一次,14,000rpm,4離心15min,小心去上清,空氣中晾幹.
      13. 10-20ul DEPC水溶解,-80保存,送測序或進行下遊實驗。

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