熒光定量PCR是指在PCR反應體係中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,zui後通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。它的出現解決了傳統PCR不能對初始模板定量分析的問題。具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優點,目前已廣泛應用於分子生物學研究和醫學研究等領域。
熒光定量PCR結果分析:
一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平台期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化;在平台期,擴增產物已不再呈指數級增加,PCR終產物量與起始模板量之間沒有線性關係,無法計算起始模板拷貝數。因此隻有在熒光信號指數擴增階段,PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關係,故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便,在熒光定量PCR技術中引入了幾個重要的概念:擴增曲線、熒光閾值、CT值。
注:
橫坐標:代表擴增循環數;
縱坐標:代表熒光強度,每個循環進行一次熒光信號收集。
(2)熒光閾值(Threshold)
在熒光擴增曲線上人為設定的一個值,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,但一般熒光閾值的設置是PCR反應前3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍。
(3)CT值
每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經曆的循環數。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係,起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代表Ct值。因此,隻要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。同時,對於熒光PCR實驗來說,CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。